因?yàn)閷讖降墓餐陌仓茫簿奂@微鏡勘探器所供給的圖畫對應(yīng)于一個(gè)薄的光學(xué)切片或是樣品的截面。例如,一個(gè)幾毫米厚的樣品在焦平面處沿z軸降最少于微米。
共聚集處的光照場通過一個(gè)被稱為針孔的孔徑所約束。視場相同也遭到一個(gè)針孔的約束,針孔的方位是相關(guān)于第一個(gè)孔徑與照耀點(diǎn)共軛的像平面上。這種共聚集裝備的成果即是降低了對散焦光的勘探,然后通過削減成像容積來添加信噪比。
Marvin Minsky首要規(guī)劃了共聚集顯微鏡并在1957年的一份專利中描繪了一個(gè)通過移動(dòng)照耀光束渠道來完成的。從樣品發(fā)來的調(diào)制光被送往光電管用示波器調(diào)查。光照耀及隨后的勘探是通逐點(diǎn)地過移動(dòng)渠道來完成的。Minsky的極具自創(chuàng)性的設(shè)想終究徹底改變了顯微鏡。
Minsky的專利被通過的時(shí)分,仍是存在有幾個(gè)技能難點(diǎn)。因?yàn)榧s束孔徑,他的體系需求非常強(qiáng)的光源。鑒于由針孔損失的光強(qiáng),在其時(shí)激光并不存在,而且也沒有別的滿足強(qiáng)的光源來激起熒光。在那時(shí)分Minsky運(yùn)用的是長期耐久的示波器做觀測,因而沒有辦法照實(shí)記載圖畫。致使別的發(fā)明者對這一特別的顯微鏡做進(jìn)一步的發(fā)展變成對一般研究者的有用東西。
發(fā)展激烈的單色光源—激光—處理了照耀的疑問。計(jì)算機(jī)裝備了數(shù)字化儀以后,使記載和實(shí)踐圖畫變得垂手可得。如今,如今掃描共焦運(yùn)用激光或結(jié)合激光作為照耀光源。這種掃描是通過精確操控振鏡以光柵運(yùn)動(dòng)的方法,用最小光斑掃過視場,就像通過電腦操控電視相同。從樣品散射或反射的熒光信號被發(fā)送到光電倍增管(PMT),這是一次構(gòu)成圖畫在屏幕上的一個(gè)點(diǎn)(像元素、像素點(diǎn))。
盡管Minsky羅列了共聚集的很多長處,或許最主要的功用即是掃描共聚集顯微鏡能夠?qū)悠愤M(jìn)行光學(xué)截面成像。傳統(tǒng)上,通過固定安排然后細(xì)心地將其切片成以便調(diào)查和成像的薄層,來獲取細(xì)胞或安排的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這個(gè)進(jìn)程需求將樣品處死,而且需求研究人員花費(fèi)好幾年時(shí)刻去學(xué)習(xí)切片技能才能將樣品切割到成像所需的滿足薄的厚度。
共聚集的光學(xué)切片功能答應(yīng)用戶對厚安排成像而不需求特別的切片竅門。它還答應(yīng)用戶對活的細(xì)胞、安排以及生物體進(jìn)行超高分辨率成像?;铙w細(xì)胞成像現(xiàn)已變成共焦顯微鏡的一個(gè)主要組成部分。
這種光學(xué)切片的才能也意味著單張切片/圖畫能夠保存到計(jì)算機(jī),然后還能夠?qū)D畫重組為樣品的三維圖畫。這在現(xiàn)有的激光掃描體系中是非常主要的特征。
此體系在熒光成像中會(huì)選用一些特別的光學(xué)元件。一個(gè)多見的誤解以為激光器發(fā)生的激光輸出只有一個(gè)波長。實(shí)踐上簡直一切的激光器都將發(fā)生諧波或散射別的波長光。盡管這些次波段的光跟主波段比較強(qiáng)度很弱,但是他們?nèi)允悄軌虼蟠蠼档托旁氡?。假如熒光的發(fā)射波段恰好落在激光諧波的規(guī)模內(nèi)(或是來自激光的別的雜光),那么熒光信號可能會(huì)徹底被掩蓋掉而勘探不到。
光路中的首要器件即是激光純化濾波片,這即是經(jīng)修飾過的激起光濾波片。因?yàn)榧す獾南喔尚院拖鄬^小的光束以及光路準(zhǔn)直的請求,這些鏡片都是要通過研磨和拋光處理的。這就與寬場顯微鏡構(gòu)成明顯的對比,因?yàn)閷拡鲲@微鏡不需求研磨和拋光。純化鏡片還應(yīng)具有極好的傳輸特性,包括波前畸變要少于每英寸一個(gè)波長。違背角(與鏡片外緣理想平行線的偏差)應(yīng)盡量減小到小于一個(gè)弧度角分,這么在同一個(gè)體系中運(yùn)用不一樣純化濾波片的時(shí)分就不用從頭糾正了。
一個(gè)純化濾波片的半波寬度(FWHM)通常是在10nm左右。它會(huì)堵塞激光光源的別的雜光(最大規(guī)模會(huì)從紫外光到1200nm)和減反射涂層來到達(dá)最大傳輸。
跟著更新、更強(qiáng)的激光器的呈現(xiàn),運(yùn)用增透膜來添加透過率就顯得沒有必要了。但是,這些光學(xué)器件選用最大反射的干涉涂層以防止熱損害,增透膜將因而削減表面反射。這些反射光不能被反射進(jìn)入激光器的共振腔。因而,這些光件被規(guī)劃用于入射角(AOI)在3.5度到5度之間。二極管激光器在熱身以后所發(fā)射的光的波長會(huì)有輕微的變化,因而,我們主張為這些光源裝備20-25nm寬的純化濾波片。在共聚集體系和一般熒光顯微體系中,為了獲得較好的平面平整度,它們有必要克服波前像差。盡管兩種體系的波前像差都操控在每英寸一個(gè)波的規(guī)模內(nèi),但在共聚集體系中挑選二向色鏡明顯能夠獲得更好的作用。
現(xiàn)在,要4-6m厚的熔融石英基片上完成二向色性現(xiàn)已很多見了,但不斷增加的需求需求用更厚的基片來消除波前像差并完成二向色性。
在過去幾年時(shí)刻里,跟著激光器的規(guī)模做得越來越大,也會(huì)有這些越來越大的功率負(fù)載可能會(huì)摧毀主鏡方面的擔(dān)心。這關(guān)于規(guī)劃杰出的二向色鏡來說不成疑問,對多見大小的光束負(fù)載最少到達(dá)8-10瓦特的功率。通過增透膜來最大極限的減小聚束光的反射使透射率最大化。
偏振也是濾鏡要思考的另一個(gè)因素。因?yàn)橐磺械墓饧饴酚衅D(zhuǎn)視點(diǎn)時(shí)都能夠充任偏振鏡,這對大多數(shù)偏振激光來說就顯得尤為主要。
一切熒光發(fā)射濾鏡的主要作用即是阻撓激起光的透過。比較較于熒光顯微鏡而言,關(guān)于共聚集體系,這種堵塞并不包括很寬的光譜規(guī)模。但是,因?yàn)榧す馐母吖β瘦敵?,需求對激光發(fā)射的特定波長專門規(guī)劃更大的堵塞(或許高于OD 8)。
對共聚集體系發(fā)射濾鏡的實(shí)踐規(guī)劃仍是存在一些爭議。因?yàn)榇蠖鄶?shù)勘探器選用光電倍增管(PMT),圖畫一次采集只構(gòu)成一個(gè)像素(圖畫元素),這些濾鏡光件就不需求打磨和拋光。但因?yàn)楣簿奂上駥Ψ直媛实恼埱笤絹碓礁?,就像別的發(fā)射濾波片相同通過打磨和拋光并不是在糟蹋精力。近期一些依據(jù)標(biāo)明,發(fā)射濾波片具有較大楔形時(shí)(光束變差)可能會(huì)形成形態(tài)學(xué)丈量的不精確,這種不精確在長發(fā)射光路中可能會(huì)更嚴(yán)峻。
激光體系的濾波片光具座是環(huán)繞激光發(fā)射而規(guī)劃的,并不一定對于特定熒光染料的最大或激起。這的確帶來有關(guān)的幾個(gè)疑問,什么樣的熒光染料才合適特定的激光體系。走運(yùn)的是,如今從熒光染料的供應(yīng)商那里能夠獲得更多的挑選了。別的也能夠挑選運(yùn)用能夠便利和快速反射多個(gè)激光束的多色主鏡。